细胞培养实验室的设置

组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作,避免微生物及其他有害因素的影响。目前,超净工作台的广泛使用,很大程度上方便了组织细胞培养工作,并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。

细胞培养实验室应能进行六方面的工作:无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。

1.无菌操作区

(1)无菌操作室:无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域,最好能与外界隔离,不能穿行或受其他干扰。

理想的无菌操作室应划为三部分:

a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间,目的是为了保证操作间的无菌环境,同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。

c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当,且其顶部不宜过高(不超过2.5m)以保证紫外线的有效灭菌效果;墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁,台面要光滑压塑作表面,漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。

无菌操作间的空气消毒:

紫外线灯—-产生臭氧,并且室内温度及湿度均较高,不利于工作人员健康。

空气过滤的恒温恒湿装置—-最好。

表1 洁净室(区)空气洁净度级别表

洁净度级别 尘粒最大允许数/立方米 微生物最大允许数 浮游菌/立方米 沉降菌/皿

100级 3,500 0 5 1

10000级 350,000 2,000 100 3

100000级 3,500,000 20,000 500 10

300000级 10,350,000 60,000 - 15

无臭氧紫外线消毒器

电子消毒灭菌器—-在高压电场作用下,电子管的内外电极发生强烈电子轰击,使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂,能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应,从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的,消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30~40min即能自行还原成氧气,空气不留异味,消毒物体表面不留残毒。

(2)净化工作台:操作简单,安装方便,占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种:a)侧流式或称垂直式 b)外流式或称水平层流式。

净化工作台工作原理(大致相同)—-通常是将室内空气经粗过滤器初滤,由离心风机压入静压箱,再经高效空气过滤器精滤,由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区,从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。

侧流式工作台—-空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧,也有从上向下或从下向上流向对侧,形成气流屏障保持工作区无菌。工作台结构为封闭式。

外流式(水平式)工作台—-净化后的空气面向操作者流动,因而外方气流不致混入操作,但进行有害物质实验操作则对操作者不利。工作台结构为开放式(已少用)。

净化工作台应用注意:

(1)净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内,以免尘土过多易使过滤器阻塞,降低净化效果,缩短其使用寿命。

(2)新安装的或长期未使用的工作台,工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作,然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。

(3)使用净化工作台前,应先用75%酒精擦洗台面,并提前以紫外线灭菌灯照射30~50min处理净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转两分钟后再进行培养操作。

(4)净化工作区内不应存放不必要的物品,以保持洁净气流流型不受干扰。

(5)注意净化区内气流的变化,一旦感到气流变弱,如酒精灯火焰不动,加大电机电压仍未见情况改变则说明滤器已被阻塞,应及时更换。一般情况下,高效过滤器三年更换一次。更换高过滤器应请专业人员操作,以保持密封良好。粗过滤器中的过滤布(无纺布)应定期清洗更换,时间应根据工作环境洁净程度而定,通常间隔3-6个月进行一次。

(6)净化工作台使用完毕应及时清理工作台面上的物品并用酒精擦洗台面使之始终保持洁净。

(7)净化工作台应定期进行功能测试,检查净化工作台各项工作指标是否达到要求,例如进行无菌试验,定期检查台面空气的洁净度是否达标。

超净工作台的无菌程度检查超净工作台在消毒处理后,无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数;取直径约90mm平皿,在超净工作台内点燃酒精灯,在酒精灯旁,以无菌操作,将平皿半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml,制成平板,在30~35℃预培养48小时,证明无菌后将平板3个,以无菌方式带入超净工作台内左、中、右各放一个;打开平皿盖扣置,平板在空气中暴露30分钟后将平皿盖盖好,置30~35℃培养48小时,取出检查,100级清洁度要求:3个平皿上生长的菌落数平均不得超过1个。

超净工作台应定期请有关部门检查其洁净度,应达到100级(一般用尘埃粒子计数仪)检测尘埃粒径≤5祄的粒数不得超过3.5个/升;空气流量应控制在0.75~1.0m3/s;细菌菌落数平均<1个,可根据无菌状况必要时置换过滤器。

2.孵育区

本区对无菌的要求虽不比无菌区严格,但仍需清洁无尘,因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行,后者费用高,一般实验室多采用孵箱进行工作。

3.制备区

在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。

4.储藏区

主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等,此环境也需要清洁无尘。

5.清洗和消毒灭菌区

清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开,主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作。

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