细胞培养中的污染(图)

细胞培养中常见的污染情况总结如下:

常见的污染如下:

1、细菌:细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状,根据感染细菌的不同,可有不同的外形,培养液一般会浑浊变黄,对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况,是否在高压灭菌时放气时间足够,压力足够!尤其是和储存培养液接触的移液管等物品,连续两次污染的话有可能造成储存液污染,一定要注意!下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象!可在培养液中加相应的抗生素处理

2、霉菌:培养液是清亮的,倒置显微镜下无杂质,37度孵箱培养2-3天,仍清亮,但出现絮状杂质,镜下可见呈细丝状的团状漂浮物,可看到明显的菌丝,细胞仍可生长,但时间长之后,细胞的活力状态变差,用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内,再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有细胞暂时转移,采用过氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时,使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后,再移入细胞。孵箱应定期清洁(2月左右),尤其在多雨的季节。其它培养箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外灯照。预防霉菌污染,可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗;但细胞一旦污染,很难挽救,制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补,建议舍弃该污染细胞。,将环境彻底消毒,如果所有细胞都污染,可能是系统污染,检查一下培养基和器材,如果只是个别污染,可能是操作问题,就要注意操作

3、支原体:黑色的,好象多为多形,培养液一般培养液一般会浑浊,原体感染,国内血清很多都没有做支原体阴性检测,而支原体是牛血清中**常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后,细胞病变不很明显,只是慢慢死去。用泰乐菌素,兽用支原体病的药,但可用于细胞培养,无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。

4、黑蛟虫:可以穿透滤膜,也可以通过空气传播,低倍下为黑色点状,高倍下可看见黑色的小虫游来游去,培养液也是不浑的,一般不会太影响,细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好,且观测到的运动物无明显增多,且培养液颜色、透明度无明显变化,可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响,在细胞增殖旺盛之后会自然消失,除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话,可以增加细胞的种板密度,以提高细胞的生存率。

5、真菌:一般培养液清亮,不变色,镜下有丝状物,有些真菌开始很像死细胞碎片,只是它很多很多的小块很清楚,象珊瑚状,不象细胞碎片分不清,慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢,不象细菌那么容易被发现,但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了,也很难救活了。

6、原虫:培养液可轻微浑浊,显微镜下那些细小的点状物数量非常多,轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢,而且细胞状态不好,边缘不清楚,细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的,但他们的数量小,细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长,只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长,**终形成恶性循环。

污染的可能原因:可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等

关于培养基的无菌状况,取培养基**培养瓶中(不加细胞),37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。也可以在培养基中事先加入双抗(硫酸链霉素和氨苄青霉素)。但双抗有时会影响细胞的状态,所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗,以避免影响实验结果。

1、孵箱应定期用三氧机消毒 或者 紫外光照射,并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水。

2、超净台、取材、器材、培养液、培养瓶、操作等因素。

3、超净台的风机不能过大,风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染。

4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后,可用同等量的氨水喷洒中和,约几小时即可进入操作。

关于黑胶虫:根据平时的操作,我觉得“黑胶虫”有没有可能是以下操作细节方面的问题导致的呢?

1、有时候血清瓶或者培养瓶上用标记笔写的字没有擦掉就直接泡酸,字迹溶解后沉积在酸缸中浸泡的瓶子里冲洗不净。

2、过火的时候不小心碰到酒精灯的灯芯,粉尘飞进培养液内。

3、有的同学习惯将移液管塞棉花的一端在酒精灯上焚烧一下,灰烬飞进培养液内。

我的细胞污染探索。某天打开孵箱,看到我的L1210的培养瓶培养液又是黄黄的,觉得很不错,今天又可以传代了,可是在镜下一看,细胞虽然明显增加了,但并没有象以前那样长满,而且更让我心惊的是怎么出现了许多黑色的小点,杆状,而且好像在动来动去,翻转,旋转,在细胞很多的地方小点就少,而在细胞较少的地方小点就多,细胞的活力也没有以前好了,**反应细菌污染,请实验室老师过来看,说不是细菌污染,这个点要比细菌的小黑点大的多,也好象不是霉菌,没有菌丝,没有常见的团壮的生长,肯定不对劲,但到底是什么,说不上来。**后,决定换液、洗涤、离心,换瓶,操作结束后镜下看黑点几乎看不到了,有点放下心来。隔天后去看,培养液还和上面的一样,但镜下,那种东西又出来了,在细胞少的地方,几乎呈现出粗砂粒样,我欲哭无泪,知道可能不行了,郁闷的换液后,回家上网·搜,一个名词跳了出来:黑胶虫。黑色、杆状、运动、细胞不会很快死亡,这些描述简直惊人的一致,我确定了,我受到了黑胶虫的袭击。但黑胶虫是什么,由于网上说法不一,我决定探究一下。首先,培养液略黄,稍有浑浊,镜下观察,细胞还没有死,但是已经不长了,那种东西已经是铺天盖地了,满眼望去,尽是粗砂粒样,细胞好像成了一个个汪洋中的小岛。细胞涂片,送到化验室,革兰氏染色,不久电话回报怀疑--真菌。**反应不可能,亲自去了化验室,看到了片上一个个瓜子样的小点,染色呈黑色。看我还有些怀疑,化验室的同事又作了滴片,镜下暗视野40倍可见一个个亮白色芝麻样的东西在游来游去,再次涂片染色仍和以前一样,并且可以见到芽孢样的形状,他们确定无疑是真菌,但不是常见的念珠军、霉菌,具体是什么,也说不上来。由于已经盖棺定论,计划的HE染色、支原体没有进行。已经将污染的细胞扔掉了。休整几天。附照片。

污染后(1)


污染后(2)


染色后

 

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