细胞房工作守则及注意事项

一、  常规操作

1.  穿着专用实验服。自己的白大衣或厚外套,可脱在门外的衣帽架上。
  2.  穿着专用拖鞋。在缓冲间换下自己的鞋子,尽量避免在缓冲间走动、停留。
  3.  细胞房最多可4个人同时使用。尽量避免在内长时间逗留、交谈。

二、  培养箱使用规则

1.  从培养箱取放物品前,用酒精清洁双手(或手套),尽量缩短开门时间和减少开门次数。
  注: 培养箱中的空气是经过过滤的洁净空气。长时间敞开或频繁开关培养箱,容易造成污染。
  2.  培养瓶皿放入培养箱前,用酒精消毒表面,并稍等至酒精挥发后再放入,以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。
  3.  2-3人共用一层培养箱,按预定位置摆放培养器皿,方便查找,以免长时间敞开培养箱。
  4.  普通培养中的细胞,若非实验需要,每瓶/板细胞每天只需要观察生长状态一次,2人以上共用的细胞,可约好时间一起观察。
  注:频繁将细胞拿出观察,容易给培养箱造成污染,同时也会影响细胞生长条件的恒定。

三、  显微镜使用规则

1.  显微镜使用前,用酒精棉从中间至周围擦拭载物台。
  2.  离开细胞房时或较长时间不需使用时,及时关上电源,延长灯泡寿命。尽量避免频繁开关显微镜电源。

四、  超净台相关操作规则

1.  超净台使用遵循预约原则。无预约者若有必要在他人预约时段内使用,需先征得预约者的同意,否则应无条件让出工作台,以免耽误他人实验。

2.  超净台使用前用紫外灯照射15分钟灭菌,使用前、后需用酒精棉球擦拭工作区消毒,所有物品放入超净台内使用前均应消毒。

3.  点燃酒精灯前需检查瓶中酒精是否足够,液面应占瓶高1/3-2/3。
  注: 消毒用75%的酒精,酒精灯用95%的酒精,向喷壶或灯内添加酒精时请留意。
  注: 酒精和酒精棉球由值日生负责补给,发现细胞房内存放量不足时请及时通知值日生。

4.  超净台中应摆放废液杯和废品杯各一只,用于暂时存放废弃物,实验结束后将杯内垃圾倒入水池或垃圾桶中,并冲洗晾干备用。
  注: 将废弃的枪头、管子内的残留液体打(倒)入废液杯后再弃入废品杯中,以免垃圾桶内留有大量培养液滋生细菌。

5.  可回收的移液管、离心管、培养瓶皿等,放入装有清水的塑料桶中浸泡,桶内需有足量的清水以没过浸泡物品。
  注: 可回收器皿必要时先初步涮洗后再放入桶内,尤其是培养瓶或血清管中有大量高营养的液体残留时,容易使桶内的清水长菌。
  保证浸泡的瓶、管内完全被清水充满,而不是在装有大量空气的情况下被压倒桶底。
  塑料桶内物品由值日生每天负责送去清洗,使用者实验结束后若发现桶已装满,请通知值日生或顺手将塑料桶带出细胞房。

6.  装培养液的瓶子、配培养液的器皿勿放入塑料桶内浸泡!应由使用者本人及时清洗晾干备用。
  注: 因桶内物品通常要浸泡几小时以上才送去清洗,此时细菌可能已在桶中生长并释放内毒素。细菌内毒素很难通过常规湿热灭菌步骤去除干净,即使干烤也不能保证其完全失活。内毒素对细胞生长及多种实验均有较大影响。

洗涤程序:洗洁精洗净,清水冲十次以上去除洗涤剂残留,然后冲去离子水3次,再用双蒸水1次,倒置于器皿柜中晾干。关上器皿柜的门防尘。

五、  培养液、试剂等相关操作规则

1.  从冰箱取放物品动作要迅速,关门时要检查门是否关好。按类别存放试剂。

  2.  培养液母液是公用,由值日生负责配制,长期存放于-20℃。使用时按比例加入血清配成培养液工作液,打开使用后的母液存放于4℃,要注意避免污染。发现4℃存放的培养液量不足时及时从-20℃中预解冻,若-20℃中已没有储备,请及时通知值日生。

  3.  分装好的血清长时间保存于-20℃,使用前放于4℃预解冻。从-20℃取用血清者需登记,并在血清管上签上使用者名字,若使用别人解冻的血清需征得同意以免耽误他人实验。按需解冻,避免反复冻融。

  4.  原则上解冻好的血清应全部配成含血清的培养基备用,若有剩余,则暂存于4℃并尽快使用。尽量不要使用他人开过的血清,以免交叉污染。

六、  值日生工作职责

1.  每周值日生时间从周六开始,至下周五结束。

  2.  值日周开始时需做的事情:在周六、日或之前准备好灭菌的枪头、离心管、干烤好的玻璃器皿,供未来一周的使用。配制消毒用的75%的酒精,制作酒精棉球,给细胞房内添加足够的95%乙醇供酒精灯使用。
  注: 新离心管灭菌前,先用去离子水过2-3次,再用双蒸水冲1次,烘干后用牛皮纸包好、灭菌。
  注:75%的酒精可用750ml 95%的酒精加去离子水至950ml配制而成。

  3.  值日周内每天需做的事情:开大紫外灯消毒细胞房15-30min;将装满浸泡物品的塑料桶拎出细胞房送洗,并将空桶放回细胞房;更换垃圾袋;检查培养箱内水量是否足够;检查灭菌物品的储备情况,以便及时补充;检查培养液母液、血清、酒精等公用试剂的储备情况。

  4.  值日周结束前需完成的事情:星期五或前后一天内打扫细胞房。包括拖地,擦桌子、吊柜、清洁和整理抽屉,擦超净台、冰箱及桌上的仪器,给水浴锅加水或换水,洗细胞房专用的实验服和拖鞋,紫外消毒细胞房。切记给培养箱换MilliQ水,保证水质清洁!
  注:若上周值日生及时给培养箱内水槽加足水,根据经验未来一周内培养箱不会干水,但值日生仍应经常检查,以便及时发现异常情况。

  5.  每2周清洁一次培养箱:先将培养箱中的物品取出暂存于超净台内,对于比较敏感的细胞可以暂存于404细胞房的培养箱;将培养箱内的不锈钢板取出,包括4块横板和左右2块立着的架子,用酒精棉球清洁钢板和培养箱内壁;打开培养箱清洁内壁时动作要迅速,避免长时间敞开门使得大量不洁净空气进入,缩短过滤器的寿命;用紫外灯照射培养箱内部15min,手提紫外灯放入培养箱前要用酒精棉擦拭干净。

  6.  配制培养液母液:培养液有RPMI1640和DMEM两种,配方见404公共配液房;配制培养基要提前干烤量筒、烧杯、250ml血清瓶,湿热灭菌滤器、血清瓶瓶盖,国产滤膜使用前用MilliQ水浸泡15min以上或过夜。

七、常用溶液的配制

1.  RPMI 1640:干粉一包,碳酸氢钠 2.0g,Hepes 2.38g,青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml,搅拌1-2小时后调节pH值至7.2,定容至1L,过滤灭菌分装;

  2.  DMEM:干粉一包,碳酸氢钠 3.7g,Hepes 2.38g,丙酮酸钠110mg,青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml,搅拌1-2小时后调节pH值至7.2,定容至1L,过滤灭菌分装;

  3.  胰蛋白酶:用D-Hanks配制,浓度为0.25%(W/V), 搅拌2小时后调节pH值至7.2,定容至1L,过滤灭菌分装;

  4.  青霉素:80万单位/瓶,加入4ml PBS,配成浓度为200000U/ml的母液;

  5.  链霉素:按质量体积比配制,用PBS配成浓度为200mg/ml的母液。

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