无菌操作原则介绍

1、环境要清洁,进行无菌操作前半小时,须停止清扫地面等工作。避免不必要的人群流动,防止尘埃飞扬。治疗室应每天用紫外线消毒一次。 
  2、进行无菌操作时,衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖,口罩须遮住口鼻,并修剪指甲、洗手。 
  3、无菌物品与非无菌物品应分别放置。无菌物品不可暴露在空气中,必须放于无菌包或无菌容器内,无菌物品一经使用后,必须再经灭菌处理后方可使用。从无菌容器中取出的无菌物品,虽未使用,也不可放回无菌容器内。 
  4、无菌包应注明物品的名称、消毒灭菌日期,并按日期先后顺序排放,以便取用,放在固定的地方。无菌包在未污染的情况下,可保存7-14天,过期应重新灭菌。   5、取无菌物品时,必须用无菌持物钳(镊)。未经消毒的用物不可触及无菌物或跨越无菌区。 
  6、进行无菌操作时,如器械、用物疑有污染或已被污染,即不可使用,应更换或重新灭菌。 
  7、一份无菌物品,只能供一个病员使用,以免发生交叉感染。 无菌操作注意事项: 
1. 实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌,以70 %  ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后,才开始实验操作。每  次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间  污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间  隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。  
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可  
以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦  拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操  作。  
3. 小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打  
开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45° 角取用,  尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。  
4. 工作人员应注意自身之安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病
毒  
感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(**少Class II)。操作过程  中,应避免引起aerosol 之产生,小心毒性药品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖锐针头之伤害等。  5. 定期检测下列项目:  5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力  
5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。  5.3. 无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300  小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。  
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水 植物外植体消毒和接种: 
用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组织培养中,外植体如果是带菌的,在接种前都必须进行表面消毒,这是取得培养成功的**基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。从室外取的材料,一般先用自来水冲洗数分钟,对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料,自来水冲洗的时间要长,几个小时或过夜,并且用洗衣粉或洗洁精洗涤,必要时用毛刷刷洗。洗后的材料用滤纸擦干,然后浸泡在消毒溶液中。接种材料使用消毒剂后,要用无菌水洗涤3~5 遍,**后用无菌纸擦干净。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的,又不能损伤植物组织和细胞,还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时,用单一消毒剂不能收到好的效果,所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。一般,首先用75%乙醇浸泡外植体数秒钟**30s,然后置于0.1%氯化汞溶液5~10min 或含有2%活性氧的次氯酸钠溶液5~30min,然后用无菌水洗涤。有时在氯化汞或次氯酸钠灭菌后,用无菌水洗,进一步剥去几层组织或器官如叶片后,再用次氯酸钠灭菌3~5min,无菌水漂洗3 次后,切割、用于接种。 
用消毒剂对接种材料进行灭菌处理时,可以在灭菌溶液中加入1~2 滴表面活性剂,如吐温80或吐温20,它们可以湿润外植体整个组织,促进灭菌液充分接触表面组织,达到较好的消毒效果。有时还可以用磁力搅拌、超声振动等方法使消毒杀菌剂进入外植体。消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行。完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。   
植物外植体消毒和接种(以胡萝卜为例): 
1 .接种前,用75 %乙醇棉球或用2%苯扎溴铵溶液擦拭超净工作台台面,将培养基及用具放入工作台,开超净工作台紫外灯照射**少20 min,然后开送风开关,之后关闭紫外灯,通风10 min后,再开日光灯进行无菌操作。 
2 .将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净,用小刀切去外围组织,切成小块分别放100 mL 烧杯中,用75%乙醇溶液浸泡30s,然后用0.1%氯化汞溶液分别浸泡2 、5 、10 min ,用无菌水洗涤3 次,无菌纸吸干水分。取出培养皿,剪刀和镊子使用前插入90%乙醇溶液中,使用镊子时在酒精灯火焰上炽烧片刻,冷却后,切取髓部组织0.5cm 。以上操作都要在试管口靠近火焰旁。
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