微生物和细胞培养中的无菌操作基本技术

无菌操作技术不仅在微生物学研究和应用上起着举足轻重的作用,在许多生物技术中也被广泛应用,例如转基因技术、单克隆抗体技术等。
 
无菌室,微生物实验室内专辟的一个小房间,室外设一个缓冲间,缓冲间的门和无菌室的门不要朝向同一方向,以免气流带进杂菌。无菌室和缓冲间都必须密闭,无菌室内的地面、墙壁必须平整,不易藏污纳垢、便于清洗,室内装备的换气设备必须有空气过滤装置。工作台的台面应该处于水平状态,无菌室和缓冲间都装有紫外线灯(距离工作台面1米),工作人员进入无菌室应穿戴灭过菌的服装、帽子。
 
超净台,主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃,通过电动装置使空气通过高效过滤器具后进入工作台面,使台面始终保持在流动无菌空气控制之下。在条件较困难的地方,也可以用木制无菌箱代替超净台(正面开有两个洞,不操作时用推拉式小门挡住,操作时可以将双臂伸进去;正面上部装有玻璃,便于在内部操作,箱内部装有紫外线灯,从侧面小门可以放进去器具和菌种、细胞株等)。
 
微生物的培养
 
在微生物的培养过程中,要保持培养物纯净性;培养微生物的要领,是为所需要的微生物提供良好的生存环境,同时阻止或抑制其他微生物的生长。
 
(一)培养基
1.认识培养基的基本组成成分,从生物体构成的基本元素这一角度理解培养基中为什么都需要具备这些基本成分。
2.培养基的用途和种类:液体和固体两大类。
3.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方;尽管培养基的配方各不相同,但是其基本成分都包括水、碳源、氮源和无机盐。
4.培养基是否合格(无菌试验):培养基在恒温箱中保温1~2d后无菌落生长(液体不变浑浊),说明培养基的制备是成功的,否则需要重新制备。
 
(二)无菌技术
 
1.  无菌技术的概念
无菌操作泛指在培养微生物的操作中,所有防止杂菌污染的方法。日常的生活环境中,每时每刻每处都存在着微生物,任何一个不经意的动作都可能将某种微生物引入到培养物中。在具备无菌环境和获得无菌材料后,还要始终保持无菌状态,才能对某种特定的已知微生物进行研究或利用它们的功能,否则外界的各种微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的现象,在微生物学叫做污染杂菌。防止污染是微生物学工作中十分关键的技术:彻底灭菌和防止污染是无菌技术的两个方面。此外,要有效避免操作者自身被微生物感染,还要防止所研究的微生物,特别是致病微生物或经过基因工程改造了的本来自然界不存在的微生物从我们的实验容器中逃逸到外界环境中去(生物安全)。无菌操作非常重要,无论是倒平板、平板划线操作,还是平板稀释涂布法,其操作中的每一步都需要做到“无菌”,只有熟练、规范地进行无菌操作,才可能成功地培养微生物。
 
2.  消毒与灭菌的概念
(1)培养细菌用的培养基与培养皿(需要灭菌)
(2)玻棒、试管、烧瓶和吸管(需要灭菌)
(3)实验操作者的双手(需要消毒)
(4)接种环、针、涂布棒:灼烧灭菌(外焰)。
 
3.倒平板
(1)灭菌后,培养基冷却到55 ℃后应及时进行倒平板操作,如果不能及时操作,需要将培养基放到55℃左右的电热箱中保温,以防止琼脂凝固(用手触摸盛有培养基的锥形瓶,感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时,就可以进行倒平板了);每个72mm培养皿需要培养基12~15ml。
(2)为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰?
答:通过灼烧灭菌,防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)平板冷凝后,为什么要将平板倒置?
答:平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后的培养基表面的湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
(4)在倒平板的过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位,这个平板还能用来培养微生物吗?为什么?
答:空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生,因此最好不要用这个平板培养微生物。
 
4.  平板划线
(1)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环?在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗?为什么?
答:操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物;每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后,接种环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加,使每次划线时菌种的数目逐渐减少,以便得到单个菌落。划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留的细菌,避免细菌污染环境和感染操作者。
(2)在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却后再进行划线?
答:以免接种环温度太高,杀死细菌。
(3)在作第二次以及其后的划线操作时,为什么总是从上一次划线的末端开始划线?
答:划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
 
5.  涂布平板
应从操作的各个细节保证“无菌”,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。例如,酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围,等等。
 
细胞培养
体外培养细胞缺乏抗感染能力,所以防止污染是决定细胞培养成败的关键。即便使用设备完善的实验室,若实验者粗心大意,操作技术不规范,也会导致污染。因而,所有操作都要最大可能的保证无菌,每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。(心中有数)
 
(一)培养前准备
在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求,准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内,然后开始消毒。这样可以避免开始实验后,因器材不全往返拿取而增加污染机会。
 
(二)操作区消毒
无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次(拖布要专用),紫外线照射消毒30-50min,超净工作台台面每次实验前要用70酒精擦洗,然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线,消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置,否则会遮挡射线降低消毒效果。实验用品,如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台,同时紫外线消毒。
 
(三)洗手和着装
原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时,可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时,因整个前臂要伸入箱内,应着长袖的清洁工作服,并于开始操作前要用70%酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
 
(四)火焰消毒
在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时,首先要点燃酒精灯。以后一切操作,如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等,都需在火焰近处进行。但要注意:烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织,以免造成组织损伤;吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼,因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜,再用时会把有害物带入营养液中;开启、关闭长有细胞的培养瓶时,火焰灭菌时间要短,防止因温度过高烧死细胞;另外胶塞过火焰时也不能时间长,以免烧焦产生有毒气体,危害培养细胞。
 
(五)操作
开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作,动作要准确敏捷,但又不能太快,幅度不能太大,以防空气流动,增加污染机会。无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便,工作台面上的用品要有合理的布局,原则上应是右手使用的东西放在右侧,左手用品在左侧,酒精灯置于中央。工作自始至终要保持一定顺序性,组织或细胞在未做处理之前,勿过早暴露在空气中。同样,培养液在未用前,不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用,应立即封闭瓶口(敞开直立可增加落菌污染机会)。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时,均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作区讲话或咳嗽,以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方,不要在打开的容器正上方操作实验容器打开后,用手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。瓶口最易污染,加液时如吸管、吸头尖碰到瓶口、瓶外,则应将吸管换掉。每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染。验结束后,将实验物品带出工作台,如需要继续进行下一个实验,则用70% 酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下一个实验操作。
 
(六)安全
工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级)。操作过程中,应避免气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO(二甲基亚砜),并避免尖锐物品伤人等。
 
(七)定期检测下列项目
 
1. CO2 钢瓶的CO2 压力
 
2.  CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换); CO2 培养箱定期消毒。
 
3.   无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300 小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。

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