实验室无菌操作

(一)无菌操作前的准备工作
培养材料接种时的无菌操作过程除上述各项消毒灭菌操作外,还需完成以下无菌操作步骤,从而获得接种的无菌培养材料。

工作人员无菌操作前需用肥皂刷洗双手及手臂,并用流水冲净,并对手臂消毒后穿戴好灭菌工作服、工作帽和口罩,更换拖鞋,才能进入无菌操作区。如进入层流操作室进行实验操作,应完成缓冲准备区内的淋浴、一次更换灭菌衣帽、拖鞋;手臂消毒、二次更换灭菌防护衣帽、手套、拖鞋等;再在风淋区进行无菌风淋后方可进入层流操作室。进入无菌操作区后,再用70%~75%的酒精擦拭双手和前臂,完成无菌操作准备工作。

用70%~75%酒精擦洗工作台面后,将已消毒灭菌的实验用品取出,并将操作器械放置在无菌器械支架上,然后开始实验操作。在实验操作过程中,对所有操作器械每次使用后都要进行灭菌,常采用酒精灯火焰灼烧灭菌。

(二)无菌操作步骤
准备工作完成后,对来自于自然生长条件下的外植体,按上述培养材料消毒方法灭菌后取出,放入已灭菌的培养皿中,然后置超净工作台酒精灯火焰下方,用灭菌剪刀等器械进行适当分离、切割或其它处理后备用。

在酒精灯火焰处将培养容器的瓶塞(盖)轻轻打开,瓶口在灯焰处旋转灼烧,用镊子将培养材料置入培养液上,将镊子在酒精瓶中浸蘸酒精,置酒精灯上灼烧后放回支架,然后迅速灼燎瓶塞(盖)数秒后塞回瓶口。对继代培养材料的无菌操作,需在灯焰处打开瓶塞(盖),继代材料为液体培养细胞时直接用灭菌吸管吸取培养细胞液放入新培养液中;继代材料为固体培养细胞时用灭菌镊子挑取适量材料置新培养液上;继代材料为其他组织时,用灭菌剪刀或其他器械进行培养材料适当切割后,用灭菌镊子将其置于新培养液上(中),然后迅速灼燎瓶塞(盖)数秒后塞回瓶口。

(三)污染源及其表现特征
当培养材料、转接器皿、无菌操作环境等消毒灭菌不彻底时,培养材料则携带有微生物(microorganism),当其被转接到营养丰富的培养液上时,微生物繁殖迅速,出现各种污染菌斑。

微生物生长时分泌出对植物组织有毒的代谢废物,致使培养材料死亡或失去使用价值。在培养过程中,培养材料附近出现黏液或混浊的水迹,并有发酵状泡沫,这是细菌性污染。在细菌性污染中,特别要注意一种呈乳白色的芽孢杆菌污染,它可出现在培养液表面,或呈滴形云雾状存在于培养液内,若出现应严格灭菌。而培养液表面出现的黄色、白色、黑色等不同颜色的霉菌,这是真菌性污染。
 

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