提取细胞RNA的方法

(一)细胞总RNA的提取
1、6孔板细胞汇合度为90-100%时,取出无菌室,去其上清,用PBS洗两次后,每孔加TRIZOL试剂 1 ml,摇匀,无菌罩内消化3-5 min。
2、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中,加新开的氯仿0.2 ml,轻摇15 s。
3、室温静置2-3 min后,12000 rpm,15 min,4 ℃,离心。然后取上清无色水相(约0.6 ml)到 EP管(DEPC处理过),加0.5 ml新开的异丙醇,室温下静置10 min。
4、12000 rpm,10 min,4 ℃,离心。观察总RNA在管底的白色沉淀,弃去上清,75%乙醇1.0 ml洗涤(用DEPC水新配制)后,7500 rpm,5 min,4 ℃离心。
5、去上清,点离,用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10 min, DEPC处理水20-30 μl加入,中枪打匀,55-60 ℃水浴10 min溶解总RNA,测OD值。
6、电泳。
(二)从总RNA中分离mRNA(Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN)
1、取上述提取的总RNA若干(少于0.25 mg)到一个新的无RNase 的EP管中,用无RNase的水定容到250 μl。
2、加入Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用Tip打匀或用手弹匀。
3、70℃水浴,3 min(裂解RNA的二级结构)。
4、20-30℃条件下,静置10 min(让Oligotex与mRNA结合)。
5、高速离心2 min,小心吸走上清(该上清要保留),留下约50 μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400 μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀,然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速离心1 min。
7、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加Buffer OW2 400 μl到柱子,高速离心1 min,丢掉滤过液。
8、将SPIN柱子移到一个新的EP管上,加20-100 μl热的(70 ℃)Buffer OEB到柱子上,用Tip来回吸打3-4 次,高速离心1 min。
9、为保证最大的 mRNA产量,可再次重复第8步。
10、电泳。

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