植物病原菌的分离实验

一、实验原理

植物患病组织内的真菌菌丝体,如果给予适宜的环境条件,除个别种类外,一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养,从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开,并从寄主植物中分离出来,再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化,这个过程总称植物病菌的分离培养。植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法,就是切取小块病组织,经表面消毒和灭菌水洗过后,移到人工培养基上培养。

二、实验目的

植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一,它对原害鉴定,病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。通过本实验,要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。

三、实验材料及准备

1.分离材料:梨黑斑病(Alternaria kikuchiana),柿树圆斑病(Pestnlotia sp)及杉木炭疽病(Glomerella cingolata)新发病的病叶;杨树烂皮病(Cytospora chrysosperma)国槐腐烂病(Dothiorella sp.)的带有新病斑的枝条;油松种子。

2.分离用具:酒精灯4个,手术剪4把,眼科镊4把,PDA培养基3瓶,培养皿(Φ9cm)24套,小烧杯(5ml)4个,大烧杯1个,斜面培养基12管,灭菌水4瓶,75%酒精瓶1个(内放脱脂棉球)0.1%升汞瓶1个,5%乳酸瓶(60ml)1个,火柴1盒,湿、干纱布各4张。

四、实验方法及步骤

(一)分离前的准备工作:

1.工作环境的清洁和消毒

分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行,无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘,并用药物或紫外线照射消毒(常用消毒药物为70%酒精,2%煤酚皂液,5%石炭酸液等喷雾。若用紫外线灯照射则需20-30分钟)。在没有上述设备条件时,在清洁房间里关闭门窗,避免空气流动,经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作,也可获得较好的结果。工作前擦净桌面,最好铺上湿纱布。将所需用的物品按次序放在工作台上,避免工作时走动,工作人员最好穿上灭菌后的工作服,带上口罩,并用肥皂洗手,用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。

2.分离用具的消毒

凡是和分离材料接触的器皿(刀、剪、镊、针等)都要随时(至少在使用时)保持无菌,将这些用具浸于70%酒精中,使用时在灯焰上灭菌烧去酒精,如此2-3次(刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长,以防退火)。再次使用时必须重复灭菌。培养皿、试验等要经过干热灭菌。培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。

3.分离材料的选择

用新发病的植株、器官或组织做为分离材料,可以减少腐生菌的污染。任何植物坏死部分的内部或表面,都可能有腐生微生物的孽生,所以一般斑点病害应从邻近健全组织,即从病、健组织交界处获得分离材料。

(二)植物病原菌的分离

1.叶斑类和枝杆病斑类(非维管束侵染)病原菌分离

首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料,按下述步骤操作:

①培养基平板制备:将PDA培养基在微波炉中加热熔化验,以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中,每皿经12毫升,可形成2-3毫米厚的平板。(为防止细菌污染,倒碟前给每三角瓶内加6%乳酸4-6滴)。

②病叶或病枝经自来水冲洗,从病斑周转1-2毫米处的健组织部位剪下(若为枝干,则将带有病斑的皮层剥下)。

③取10毫升小烧杯经酒带消毒,放入分离材料,倒入0.1%升汞液适量作表面消毒一分钟,或用1%漂白粉消毒均可。

④消毒后倾出消毒液,用无菌水冲洗2-3次,最后一次无菌水不要倒掉。

⑤用灭菌镊,剪在无菌水中将分离材料剪成2-3毫米大小的方块,每块组织均应为病健相间组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料,放入培养基平板上,轻轻按压。每皿4-5块,排放均匀。

⑥用蜡笔在培养皿上注明分离代号,日期、姓名,将培养皿翻转放置于23-25℃

⑦3-4日后挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落,在菌落边缘用移菌针挑取带有菌丝的培养基一小块,转入试管斜面培养基中央,于25℃温箱中培养。

2.种子内病菌的分离

将整粒种子或种子的一部分进行冲洗,再经表面消毒(升汞或漂白粉),最后用灭菌水洗涤后移到人工培养基平板上培养(或者直接放在皿内保湿培养于25℃温箱中)。

3.有害输导组织病原菌的分离(以枯萎病为代表)

先将分离茎作表面消毒,然后用灭菌刀剥去表皮,剪取其中小块变色的维管束组织,再用漂白粉进行表现消毒后,移于培养基平面上培养。

(三)分离物的纯化

前述方法获得分离物,必须经过纯化,才能成为培养,纯化的方法有单孢子分离法和边续稀释培养法两种,后者简便,为了一般研究所常用。

连续稀释法:对真菌材料来说,就是从典型菌落边缘切取含有菌丝的培养基一小块,移植于另一培养基平板上,待菌落形成后,再依此法移植。如此数次,直至菌落形态典型,无杂菌时即可移入斜面试管中培养保存。


附:

1、0.1%升汞液的配制:升汞1克,浓盐酸2.5毫升;加水1000毫升。注意要先将升汞用盐酸溶解,然后加水稀释。

2、P.D.A培养基成分;马铃薯200克,葡萄糖10-20克,洋菜17-20克,水1000毫升。

3、水洋菜培养基成分,洋菜17-20克,水1000毫升。

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