无菌操作基本技术

1、实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌,以70%ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后,再进行下一个细胞株之操作。

2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其它实验用品用完即应移出,以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域,勿在边缘之非无菌区域操作。

3、小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4、工作人员应注意自身之安全,须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作,并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中,应避免引起aerosol 之产生,小心毒性药品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖锐针头之伤害等。

5、定期检测下列项目:

5.1 CO2 钢瓶之CO2 压力

5.2 CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换)。

5.3 无菌操作台内之airflow 压力,定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。

6、水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水

工作浓度的胰酶是不是应保存在-20度?如果放在4度冰箱可以保存多久呢?是不是几个小时就会失去活性?

平时放在-20度,分装在50毫升螺口管,用时拿一管放4度用。

1、认真按照操作规程进行实验,一般不大会导致污染,很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败,

2、粉末培养基配制好后(加了血清),一般在4度尽量不要超过1个月,如在-20度存放时间可长一些,但最好也不要超过3-4个月,可能对于永生化细胞株来说要求不是太高,但我在过去的4年里一直是作原代细胞培养的,细胞娇弱,经验表明放置时间不宜过长。

3、关于实验用品的清洗与消毒,我的经验是:用过的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上,然后加少许清洗剂,以超声波洗涤30min左右,(如无超声波洗涤器可用软毛刷轻轻刷洗干净),捞出晾干,再在铬酸洗液中浸泡6-18h(或过夜)后,自来水清洗10-15遍,双蒸水清洗3-4遍,晾干,高压消毒后即可使用。

许多塑料制品也可以高压消毒,例如培养瓶盖,胶塞,吸头等。不能用于高压的一般均已制成一次性作用的商品了,当然如果money有限,如进口的培养板、皿等,也可以重复使用1-2次,我当时使用方法是将其完全清洁后,使用前在紫外灯下敞开照射1-1.5h即可,我做过多次,没有出现问题。塑料培养瓶由于清洗消毒不便,最好不要重复使用,如一定要重复用,可用环氧乙烷等消毒,(消毒后一定要放置半年以上方可使用)

在光镜下,上皮细胞通常呈“铺路石”样排布,细胞之间有拉丝现象(即距离较远的细胞可以通过细长的触手相连),细胞有成片生长的特性。而间质细胞通常呈梭形,没有有成片生长的特性,细胞之间的联系不紧密。但是细胞的形态特征会因为生长条件的改变而改变,如HeLa细胞是上皮细胞,但是在酸性培养条件下会变为梭形。

上皮细胞之间都有特征性的紧密连接(桥粒)结构,因此可以通过观察培养细胞的超微结构来判断细胞的类型,如果有紧密连接,就必然是上皮细胞。这是一锤定音的证据。注意不要把细胞消化下来做电镜,要用细胞刮刮下来后做电镜。

此外每一种上皮细胞都有其特征的细胞角蛋白的表达(cytokertin, CK),可以查一下子宫内膜腺上皮细胞表达的CK分子,然后进行免疫细胞化学的鉴定。

细胞在偏碱的情况下培养,耐受能力会逐渐下降,可能是产生脱壁现象的原因,后来我重新测了一下培养基,为7.5左右,我用灭菌的HCL调了一下,培养基颜色变成淡红透亮,再次培养,发现细胞贴壁比较好了,搏动效果也不错,因此,我以后每次培养前都要重新调好PH值,我觉得很多因素是能影响PH值的

血清质量不好,影响了细胞生长。所以,我认为以后养细胞,用的血清浓度最好是每批次血清都摸一下,不一定要以参考文献为准,毕竟国产的血清质量差异比较大啊。

细胞无菌操作是关键,对于配制培养液时,有些人为了让培养粉充分溶解,搅拌4小时或更长时间。其实这完全没有必要,一般培养基的固体组分还是易溶于水的,搅拌的时间长了会增加污染机会,虽然后来滤过除菌了,但细菌的代谢产物比如脂多糖谁能够把它滤掉?细菌的代谢是很快的,甚至在常温下20min就可以繁殖一代,太可怕了。我的经验就是搅拌30min-60min就把它过滤。

另外关于培养基的pH问题,一般按照说明书操作,加入所说的NaHCO3量,与预计的pH不会有什么距离,也就是说基本上不用调pH,如果相差大,要考虑三蒸水的质量是否有所下降,当然这时调pH也是不得已而为之。我配培养基时基本上不调pH,只是用试纸检测一下pH,观察一下培养基的颜色。

(1)东西一定要用自己的。既不要借别人的,也不要借给别人。可能大家觉得比较自私。实际上还是很有好处的。并不是每个人的操作都规范,因此相互之间串着用,很容易造成交叉污染。(2)我习惯口对口倒液体,在倒前倒后都要在酒精灯上过一下。自己认为比起用吸管吸更能很好的防止污染。步骤越简单,越能防止污染。而且还能节省很多吸管。

(3)一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要做到半路,又出工作间拿东西,这样增加了污染的机会。

(4)整个操作要快、动作要轻、而且不要干其他的事情。比如手机响了,最好不要接。我一般操作的时候将手机关了,手机声音响起,好烦躁。

(5)我一般开紫外线照射台的时候,就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后,温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生,有的常年不清洗,里面很脏,容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水域锅那出后,最好找个毛巾插干上面的水。

(6)操作前要洗手,用75%酒精搽手。用完操作台,要打扫卫生。

细胞要经常冻存,我一般只要细胞状态好就将细胞冻存起来。细胞状态差了,扔掉,重新复苏。这是一个必须养成的习惯。毕竟很多情况下,细胞并不是因为污染了,才让你感到头痛。这样你不会担心没有种子了。我一般是不加双抗的,只要注意,不会污染。

过滤时不要用枪吹细胞!! 如果用力吹,筛网就像刀片一样,把你的细胞全部切碎!!

刷玻璃器皿的过程:初洗、泡酸(一天)、自来水冲洗(10遍)、纯化水冲洗(3遍)、注射用水冲洗(3遍)。感觉过于苛刻,自来水只冲洗3遍。被老师发现后,一阵痛批,才知道这是极其关键的一步,残留的酸可能会抑制细胞生长,甚至导致细胞死亡,痛失辛苦得来的细胞,心血付之东流。无知不能无畏,一定不能大意。

做好准备工作。不要急于投身到细胞培养中去,要先设定计划:步骤,工具,试剂。特别是将细胞用于大规模生产时,尤其如此。eg.经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态,如果准备多了,用不完的就得重新灭菌,耗费能源、占用灭菌空间,不值得;干热灭菌需要一天的时间,当器皿准备不足时,只能干着急,错过了最佳操作时间,也许得很久才能将细胞状态再调整好。

对于骄气的细胞,我一般都是第一天处理完后,加少量培基(够盖住瓶底部),第二天换液,以免死细胞和碎片对活的产生不良影响。

新配的培养基直接用很清亮,但是在-20度保存一段时间后再溶解就要出现很多杂质,用37度水孵育没有效果,握在手里不停摇动非常有效。其实对于操作熟练的人来说,污染并不是我们想像那样容易出现,园子里很多人都问否污问题,而培养基的PH值往往被忽略,而且大多数人都习惯于一次配制1升培养基,分装成10X100ml,用1瓶,另外9瓶放在-20度保存,很容易出现结晶,镜下看就是一些杆状的物资,有时候晃动培养基,肉眼就可以看到很多沉淀,这就需要我们在用之前好好摇匀了。

操作中的安全 :a.我犯的一个巨经典的错误至今难忘,刚做时酒精擦手,擦镊子,湿淋淋的就拿镊子过火,结果。。。。火顺着镊子着到手上,虽然不怎么热,可是我手上的汗毛啊,555,都被烧了。这个错误以后再也没犯。b.过完火的试管口一定不能摸,时刻记着只拿试管的下1/2。c.给酒精灯加酒精永远记住不要拿酒精灯口那个灯心管,否则终身难忘。d.当酒精灯出现什么意外时一定要镇静,先让他着一会可能没事,不要慌乱中打坏别的东东。e.离心机尤其高转速时,配平当然要牢记,可是一定要检查一下离心机里还有没有其他东东(有一次我离东西,着急,放进去刚离一会我就觉得声音不对,打开一看里面竟然有一根别人没有拿出来的小管子)。还有一次配完平就打开离心机盖准备离心,结果吓个半死,原来别人正在离心,幸好管子没飞出来

细胞冻存: 当细胞状态好,或者代数比较早,一定要大量冻存,不要吝惜暂时的大批使用血清,当细胞状态不好,长不起来的时候,马上取出来复苏,省时省力,不要去尝试努力恢复状态不好的细胞,费时间也费血清,会令你痛苦不堪。另外冻存的细胞不要放到一个地方,-80度,液氮(甚至不同的液氮罐)都放一点,谁也不敢保证不出意外,冰箱也可能有化的时候(我们-20度冰箱就化过),都放在一块容易全军覆没。

按照试剂的保存标准保存,象血清、胰酶等没开封的-20℃,开封后-4℃保存一般不超过7天(用完它吧,不然浪费了)

一定要弄清楚每个组分的作用,特点,比如NaHCO3容易分解,因此培养基在过滤除菌时pH会上升,一般是0.1-0.3,所以在过滤之前,要把培养基的pH调低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特点,就不会做相应的处理,那么培养基不符和要求,细胞就长不好

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况,用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟,在显微镜下观察即可,活细胞不被染色。方便易用,因此在实验室中比较常用,尤其在心肌细胞原代培养中。

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